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慢病毒

慢病毒载体

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慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒可将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
　　
　　慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂（图1）。

　　图1 慢病毒包装和侵染细胞的过程
　　
　　慢病毒载体具有宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。
　　
　　慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达，因而可构建稳定细胞株，用于基因的细胞功能研究。借助慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗。



慢病毒包装与纯化

　　慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装，收集细胞培养上清，通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。


慢病毒滴度检测

　　检测方法：定量PCR检测感染后细胞基因组中外源DNA拷贝数
　　
　　实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组


慢病毒载体优势

① 表达时间长：慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上，实现基因长时间稳定的表达，不随细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选，常用于构建稳定株。
② 安全性高：未发现致病性，慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗。
③ 免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验。
不同病毒的生物学特性比较
载体选择
　　K8凯发生物拥有丰富的慢病毒产品，用于操作编码基因和非编码基因，如lncRNA、microRNA、circRNA，如下慢病毒载体可供您选择（不限于此列表）：
调控方式 载体编号 载体名称（载体元件顺序） 真核抗性 荧光 启动子 默认标签 载体容量
   过表达 GL127 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE N/A EGFP CMV 3FLAG 4.8kb
GL121 pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE N/A EGFP CMV N/A 4.4kb
GL129 pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-WPRE N/A mCherry CMV 3FLAG 4.8kb
GL119 pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro N/A CMV 3FLAG 4.4kb
GL120 pSLenti-SFH-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.5kb
GL107 pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.7kb
GL109 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro EGFP CMV N/A 3.8kb
GL122 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE blasticidin EGFP CMV N/A 3.9kb
GL130 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.7kb
GL132 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS Puro EGFP CMV N/A 3.7kb
GL123 pSLenti-EF1-mCherry-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro mCherry CMV 3FLAG 3.7kb
GL125 pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro mCherry CMV 3FLAG 3.7kb
GL133 pSLenti-EF1-mCherry-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS Puro mCherry CMV N/A 3.7kb
H114 pLenti-CMV-Luc2-IRES-Puro-WPRE Puro N/A CMV N/A 2.2kb
GL124 pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro N/A CMV N/A 2.8kb
 表达cre H126 pLenti-CMV-NLS-Cre-3xFLAG-WPRE N/A N/A CMV 3FLAG 3.9kb
H15108 pLenti-CMV-DIO-MCS-WPRE N/A N/A CMV 3FLAG 5.3kb
三标 H7656 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-Puro-WPRE Puro mNeonGreen CBh 3FLAG 1.3kb
H7657 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-Puro-WPRE Puro tdTomato CBh 3FLAG 0.6kb
H9911 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-BSR-WPRE blasticidin mNeonGreen CBh 3FLAG 1.5kb
H9912 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-BSR-WPRE blasticidin tdTomato CBh 3FLAG 0.8kb
circRNA过表达 H8384 pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-S-circRNA-WPRE N/A EGFP CMV N/A 3.0kb
H8807 pLenti-CMV-S-circRNA-WPRE N/A N/A CMV N/A 4.8kb
H8399 pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-L-circRNA-WPRE Puro EGFP CMV N/A 1.0kb
H8810 pLenti-CMV-L-circRNA-WPRE N/A N/A CMV N/A 2.8kb
miRNA过表达 GL109 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro EGFP CMV N/A N/A
H3919 pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP U6 N/A N/A
H119 pLenti-CMV-TurboGFP-IRES-Puro-miR30(miRNA)-WPRE Puro TurboGFP CMV N/A N/A
H3928 pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE Puro mCherry U6 N/A N/A
H146 pCLenti-EF1-Puro-CMV-EGFP-3xFLAG-Sponge(miRNA)-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG N/A
H7505 pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-BSR-WPRE blasticidin EGFP CMV N/A N/A
H7506 pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP CMV N/A N/A
过表达（Tet-on） H125 pLenti-TRE-EGFP-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE Puro EGFP TRE N/A 2.0kb
H121 pLenti-TRE-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro EGFP TRE 3FLAG 3.3kb
H2057 pLenti-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE Puro N/A EF1 N/A N/A
shRNA干扰 GL401 pCLenti-U6-shRNA-CMV-Puro-WPRE Puro N/A U6 N/A N/A
GL404 pCLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-WPRE N/A EGFP U6 N/A N/A
GL427 pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP U6 N/A N/A
GL428 pSLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE Puro mCherry U6 N/A N/A
H7615 pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-BSR-WPRE blasticidin mCherry U7 N/A N/A
CRISPR敲除 H5070 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE Puro N/A U6 N/A N/A
H7072 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE blasticidin N/A U6 N/A N/A
H6825 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE N/A sfGFP U6 N/A N/A
H5068 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE N/A EGFP U7 N/A N/A
H5450 pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE Puro N/A CMV 3FLAG N/A
CRISPRa转录激活 H9517 pCLenti-U6-gRNA-MS2-EFS-dCas9-VP64-T2A-BSD-WPRE blasticidin N/A U6 N/A N/A
E2577 pCLenti-EF1a-MCP-P65-HSF1-T2A-Hygro-WPRE hygromycin N/A EF1a N/A N/A
H7284 pCLenti-U6-gRNA-2x(wt+f6)MS2-CMV-MCP-P65-HSF1-IRES-BSR-WPRE blasticidin N/A U6/CMV N/A N/A
H7281 pLenti-CMV-dCas9-VP64-T2A-Puro-WPRE Puro N/A CMV N/A N/A


常规应用

　　体外感染细胞
　　
　　慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。
　　
　　慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，因而可以达到持久性表达，从而构建稳转细胞株，体外进行细胞功能学实验，包括细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等研究。稳定表达目的基因的肿瘤细胞株还可以进一步构建肿瘤动物模型，进行体内基因功能验证，药效药代，活体成像等检测，进一步研究体内肿瘤发生、发展和转移及药物治疗的效果。
 


　　常见MOI列表
细胞名 中文名称 慢病毒感染MOI
（参考值）
MGC80-3 人胃癌细胞 10
HT-29 人结肠癌细胞 20
RKO 人结肠腺癌细胞 10
Caki-1 人肾透明细胞癌皮肤转移细胞 10
5637 人膀胱癌细胞 10
U-118 MG 人脑星形胶质母细胞瘤 10
RWPE-1 人正常前列腺上皮细胞 20
HeLa 人宫颈癌细胞 10~20
Ca Ski 人宫颈癌肠转移细胞 10
MCF7 [MCF-7] 人乳腺癌细胞 10
A549 人非小细胞肺癌细胞 10
NCI-H1299 人非小细胞肺癌细胞 20
U-87 MG 人脑星形胶质母细胞瘤 10
U251 人胶质瘤细胞 10
A172 人胶质母细胞瘤细胞 10
K-562 人慢性髓原白血病细胞 10
HL-60 人原髓细胞白血病细胞 10
GES-1 人胃上皮细胞 20
U266 人骨髓瘤细胞 20
CAL 27 人舌鳞癌细胞 20
PC9 人肺癌细胞 5
PC14 人肺癌细胞 10
MADB-106 大鼠乳腺癌细胞 20
F98 大鼠脑胶质瘤细胞 20
MHCC-97H 人肝癌细胞（高转移） 10~20

　
　　MOI 是multiplicity of infection 的缩写，即感染复数，其含义是感染时病毒与细胞的数量比值，一般以实验中某个细胞，感染达到80%，定义为这个细胞的MOI值，即病毒量与细胞数的比值；加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000


慢病毒在肿瘤研究中的应用案例
 
1.Nature Communications. (IF=12.353). Shi Y,et.al. (2017). Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.[慢病毒, 胶质细胞瘤]
慢病毒干扰： Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1
2. Hepatology. (IF=14.079). Ma JZ,et.al. (2016). METTL14 suppresses the metastatic potential of HCC by modulating m6 A-dependent primary miRNA processing. [慢病毒, 肝癌]
慢病毒过表达/干扰：pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro
 
慢病毒在神经系统的应用（在体注射）
1．Nature Neuroscience. (IF=19.912). Ding XL,et.al. (2017). Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. [慢病毒, 学习与记忆]
病毒类型：慢病毒
载体名称：LV-Suv39h1-RNAi（不确定详细的）
注射部位：海马DG区
病毒注射量：2 μL，9.98 × 108 TU/mL
检测时间：2周
 
2．Nature Communications. (IF=12.353). Yao XH,et.al. (2016). Electrical coupling regulates layer 1 interneuron microcircuit formation in the neocortex. [慢病毒, 神经环路]
病毒类型：慢病毒
载体名称：LV- CX36-shRNA-EGFP（不确定详细的）
注射部位：P1小鼠新皮层L1
病毒注射量：1μL
检测时间：2周
3．Molecular Psychiatry. (IF=11.64). Guo DJ,et.al. (2019). Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. [慢病毒, 自闭症]
 
病毒类型：慢病毒
载体名称：Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1
注射部位：小鼠海马CA1区
病毒注射量：1μL
检测时间：4周
 
慢病毒延伸服务
 
K8凯发生物慢病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采用三质粒或四质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。一般情况下K8凯发·(中国)天生赢家·一触即发的慢病毒的滴度在108~109TU/ml，完全可以满足各类实验的使用要求。
咨询服务热线：021-58585887   联系人：姜女士    联系电话：13501676670 联系邮箱：jxl@xianfangshuibulou.com
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