外显子组测序

　　外显子组(Exome)是一个物种基因组中全部外显子（Exon）区域的总和，该区域包含着合成蛋白质所需要的信息，涵盖了与个体表型相关的大部分的功能性变异。外显子组测序&目标区域测序是指利用特制的探针对感兴趣的蛋白编码区域DNA或某段特定序列进行富集，随后通过高通量测序技术对该目标区域进行深度测序，发现特定遗传信息，极大提高了基因组中外显子&目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。该技术可用于鉴定和研究孟德尔疾病，复杂疾病如癌症、糖尿病、肥胖症等的致病基因和易感基因，进行群体研究，如人类罕见遗传变异，肿瘤突变基因研究等，帮助研究人员更好地解释这些疑难杂症的致病机理。

技术优势

高捕获效率
采用捕获效率更优异的Agilent Human SureSelect V6 kit（58M）进行外显子组捕获。

可靠的基因突变鉴定方案
采用不同的针对性方案进行遗传病与肿瘤突变基因的可靠鉴定权威的突变鉴定软件：采用权威的GATK，muTect，VarScan2等软件更准确鉴定突变

技术路线

混合克隆稳定细胞株

基因组DNA
文库构建
外显子&目标区域富集
上机测序（HiSeq 4000，PE150）
数据分析

分析内容

人外显子组测序（遗传病）	标准数据分析	数据产出统计；测序深度、覆盖度分布统计； SNP鉴定与注释；插入/缺失（InDels）鉴定与注释。
人外显子组测序（遗传病）	高级信息分析	dbSNP数据库的注释与筛选；1000 Genome数据库的注释与筛选；位点基因区域的筛选；蛋白功能影响注释；遗传模式筛选（显性，隐性，复合杂合）
人外显子组测序（肿瘤）	标准数据分析	数据产出统计；测序深度、覆盖度分布统计；SNP鉴定与注释；SNP的疾病与临床数据库注释；插入/缺失（InDels）鉴定与注释；插入/缺失（InDels）的疾病与临床数据库注释；CNV检测。
人外显子组测序（肿瘤）	高级信息分析	dbSNP数据库的注释与筛选；1000 Genome数据库的注释与筛选；位点基因区域的筛选；蛋白功能影响注释；遗传模式筛选（显性，隐性，复合杂合）
人目标区域测序	标准数据分析	数据产出统计；目标区域单碱基深度分布图；目标区域捕获测序的均一性；一致序列组装和SNP检测；SNP注释；插入/缺失（InDels）检测与注释
人目标区域测序	高级信息分析	氨基酸替换预测；群体SNP检测和等位基因频率估计；孟德尔遗传病分析；NGS-GWAS分析（200对以上样本）；正向选择信号的检测SNPs变异信息检测（群体样本）

样本类型

细胞，组织，全血，血清，血浆，总DNA等
建议总DNA起始量：5 μg，最低1 μg，浓度≥50 ng/μL（Qubit定量）

结果展示

1.与基因组比对（覆盖度、测序深度）
样品比对率是指比对到参考基因组上的数据量占有效测序数据量的比值，反映样本与参考基因组的相似性。测序深度是指比对到参考基因组的碱基总数占基因组的比值；覆盖度是指被测到的该物种基因组碱基总数占该物种基因组长度的百分比。

2.SNP分析
SNP全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。基因组上单个核苷酸的变异包括置换，缺失和插入。采用FreeBayes对各样品比对结果进行个体SNP的检测。

3.InDel分析
InDel (Insertion-Deletion) 是指相对于参考基因组，样本中发生的小片段的插入缺失，该插入缺失可能含一个或多个碱基。根据InDel在基因组中的位置，可以分为编码区序列的InDel和非编码区序列的InDel。编码序列中的InDel发生与编码蛋白质的功能和氨基酸位点在结构和功能上的重要性有关。采用FreeBayes对各样品比对结果进行个体InDel的检测。

常见问题

1.什么是copy number variation （CNV）基因组拷贝数变异？
基因组拷贝数变异是基因组变异的一种形式，通常使基因组中大片段的DNA形成非正常的拷贝数量。例如人类正常染色体拷贝数是2，有些染色体区域拷贝数变成1或3，这样，该区域发生拷贝数缺失或增加，位于该区域内的基因表达量也会受到影响。如果把一条染色体分成A-B-C-D四个区域，则A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D分别发生了C区域的扩增及缺失，扩增的位置可以是连续扩增如A-B-C-C-D也可以是在其他位置的扩增，如A-C-B-C-D。

2.癌组织为什么要采用高深度测序？
相对于遗传病而言，肿瘤组织样品中突变位点的等位基因频率较低，一方面由于肿瘤细胞在肿瘤组织中的占比偏低，另一方面则由于癌症发展后期产生的突变仅存在于极少量的肿瘤细胞中，采用高深度测序可以尽可能全面的检测到与癌症发生发展相关的变异。通常推荐的外显子测序深度为，癌组织大于150x，癌旁组织/血液大于50x。

3.人外显子测序一般推荐多少测序深度？
建议有效测序深度在100x以上。有文献显示外显子组测序深度会影响变异检出率，随着测序深度的升高，变异检出率增大，且达到一定深度时，变异检出达到平稳状态。

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