福尔马林固定石蜡包埋（Formalin Fixed Paraffin Embedded，FFPE）样本是临床上长期保存病理样本的常用方法，可以和临床数据（如患者临床资料，患者生存预后信息，用药和治疗疗效等）相关联，为确定疾病的发生发展机制研究、生物标志物和药物靶标提供了巨大的资源，是进行回顾性研究的不二之选。但FFPE处理会使组织中的核酸发生不同程度的降解，在过去由于技术受限使FFPE样本无法发挥自身的价值。随着技术的不断突破，针对石蜡样本提供了全套的解决方案。

10x Genomics Flex可锁定 RNA 的瞬时表达状态，解决了单细胞样本储存运输、多样本批量处理以及混样测序的问题。针对FFPE样本，使用二jia ben脱蜡，使用胶原酶、胰蛋白酶等多种酶来消化组织，制备单细胞悬浮液，进而抽核得到细胞核样本；建库时采用靶向基因的探针对杂交目标 RNA 分子后连接的原理，进而完成文库构建的过程。10x Genomics Flex可以用来分析数千个至数万个细胞核的基因表达，能够对人或小鼠的 FFPE 样本进行单细胞转录组分析。

图1. 10x Genomics Flex工作流程

应用案例：FFPE组织的单细胞+空转+原位分析联合绘制高分辨率乳腺癌微环境图谱

该研究对一个乳腺癌FFPE 样本进行连续切片，采用单细胞基因表达（Flex，scFFPE-seq），空间转录组（Visium CytAssist）和原位技术（Xenium）对乳腺癌FFPE 样本进行检测。通过这三种数据的联合分析，实现了FFPE样本单细胞水平下基因表达，空间信息及原位基因表达信息的整合。其中Flex和CytAssist数据联合分析鉴定出17种不同的细胞类型，再通过将转录本映射到 Xenium中，以单细胞分辨率在空间层面上解析这些细胞类型及其基因表达特征，从而展示了样本高空间分辨的全转录组信息。

图2. FFPE Flex和CytAssist的细胞类型注释

10x Visium CytAssist技术方案一经推出就备受瞩目，不仅完美解决了传统方案在FFPE样本的痛点，并且对样本要求更低，以卓越的数据表现备受好评。基于CytAssist仪器进行检测，可根据组织大小进行灵活选用（6.5mm×6.5mm 或11mm×11mm）。

图3. 10x Visium CytAssist玻片

与标准Visium完全不同，相比于标准Visium的55 μm 点阵、六边形排列的信号点，HD则采用了2 μm的方形连续网格图案，彼此之间没有间隙，大大提升了信号密度，可以实现单细胞的分辨率。Visium HD平台提供了全转录组测序，兼容物种为人和小鼠，兼容组织类型是FFPE组织样本。Visium HD支持定位组织驻留细胞群，包括免疫细胞或癌细胞，发现它们的相互作用和对疾病或治疗反应的贡献。

图4. 10x Visium HD玻片

应用案例：10x HD空转解析肠癌微环境

Visium HD的单细胞分辨率能够绘制不同的免疫细胞群，并评估肿瘤边界的不同基因表达，以探索免疫细胞群在TME中的潜在贡献。结直肠癌是一种影响结肠或直肠的癌症，是全世界最常见的癌症类型之一，可以导致严重伤害和死亡，结直肠癌的风险随着年龄的增长而增加。该研究将全转录组和靶向原位空间技术相结合，深入地揭示了TME的复杂性和动态性，突出了空间环境对理解癌症异质性和进展的重要性。

图5. 研究路线

转录组研究对于理解基因组功能元件、揭示细胞及组织中分子组成以及探索机体发育和疾病机制具有重要作用。通过高通量测序对FFPE中lncRNA 和mRNA进行测序分析。

石蜡样本实测数据显示：

1）取4个不同降解程度的FFPE-RNA样本(DV200在60%-80%之间)，用其进行文库制备文库及NGS分析。

2）4个FFPE样本的基因组比对率均在85%以上，且均有较高的转录本检测数。

图6.各样本FPKM小提琴图

基于FFPE样本开展差异蛋白质组学研究，可以充分利用罕见疾病或肿瘤等样本，研究疾病发病机制，发现与疾病诊断、分型、预后与治疗密切相关的生物标志物。采用DIA或 Astral技术进行全景式的数据采集，无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，更大程度鉴定样本中的低丰度蛋白。

FFPE实测数据显示：

结合SDS PAGE条带和蛋白总量进行质检判定，用其进行质谱分析。

FFPE样本的蛋白鉴定数可达到4000+。

图7.FFPE SDS PAGE结果

全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)指利用捕获技术将全基因组的外显子区域DNA捕获富集后进行高通量测序，能够直接发现与蛋白质功能变异相关的单核苷酸位点变异（Single nucleotide variants，SNV）、插入缺失位点（InDel，Insertion/Deletion）和结构变异位点（SV，Structure Variation）等信息。以人类基因组为例，虽然外显子(蛋白质编码区)只占基因组的1%，但人类基因组85%致病突变都在外显子区域，因此具有重要意义。

FFPE WES实测数据显示：

平均捕获率（ontarget ratio）可达到60%-80%以上。

参考文献